RNA干扰(RNAi)是在植物、动物、线虫、真菌以及昆虫等生物体中普遍存在的通过双链RNA(dsRNA)诱导的抑制同源基因表达的一种保守的调控机制。小分子RNA（miRNA）通过碱基互补的原则识别并且结合RNA诱导的沉默复合体(RISC)，对目标mRNA的转录和翻译进行抑制。这种识别碱基对的方法使得一个给定miRNA的靶基因比较广泛。科学家们一直都很好奇，在靶mRNA数量上极大地超过miRNA的这种情况下，miRNA是如何能够调节这些靶mRNA的。

作为RISC的重要组成成分,Argonaute蛋白(Ago)当然在其间发挥了至关重要的作用。miRNA识别靶序列对Ago蛋白降解其同源目标的这个反应过程有直接的动力学影响。但是我们尚不知还有没有其他机制参与小分子RNA诱导的基因沉默过程，直到美国德州大学西南医学中心（UTSW）分子生物学教授Joshua Mendell博士（论文通信作者）等人于2017年1月23日发表的这篇Nature期刊文章：“An Argonaute phosphorylation cycle promotes microRNA-mediated silencing”。

人细胞无法通过RNAi筛查来剖析miRNA信号通路，因为两通道共用一套分子机制。现在，CRISPR基因编辑技术则允许研究人员关闭上百万个细胞中每个细胞内的一个不同的基因。研究人员采取增强型绿色荧光蛋白（EGFP）转录物结合miRNA的方法来标记细胞的miRNA活性：当关闭参与这种miRNA通路的基因时，细胞产生更多的绿色荧光。具体来说，研究人员针对超过19000种人类基因和1864种miRNA设计了慢病毒库，最亮的0.5%被挑出来认为这些细胞的基因沉默过程是有缺陷的，这些基因背后就是miRNA-mRNA相互作用的磷酸化机制。

研究人员通过高通量测序枚举sgRNA，按照RNAi基因富集程度排名（RNAi Gene Enrichment Ranking algorithm），辨识那些受多种sgRNA同时针对的基因，期间miRNA通道的各种环节甚至miR-19本身都被高亮，展现了该方法的灵敏性。

期间转录因子BRD4, CTNNB1被发现（通过MYC，间接地）参与调控miR-19的转录，POU2F1（通过结合启动子）促进pri-miRNA的转录，这两点已有科学家报道过。

另一突出发现就是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶中酶活不依赖于金属离子（PPP家族）中PP6（本文称PPP6）的交互元件，包括其唯一的催化亚基PP6C（本文称PPP6C）以及3个含锚蛋白重复序列(ankyrin repeat)之一的ARS-C（本文称ANKRD52），这两者在miRNA 信号通路中都是没有报道过的。这暗示磷酸化在miRNA信号通路中的重要性。ANKRD52基因敲除后的RNA测序重新证实了这一点。

至于为什么会这样，研究人员假设Argonaute蛋白是经ANKRD52–PPP6C 去磷酸化。他们采用Phos-tag方法检测磷酸化蛋白质，可见缺乏ANKRD52–PPP6C的细胞会积聚磷酸化的AGO2，这些蛋白移动得特别慢。质谱法对其中磷酸化残基的检测将研究人员的目光集中在了PIWI结构域S824–S834区间，该区间的5个氨基酸表现出过度磷酸化。把它们全都（或仅S828）突变掉能导致前述Phos-tag 实验现象的逆转，同时miR-19荧光信号减弱，miRNA诱导的基因沉默过程受阻。

研究人员接下来想认识能够启动这种抑制机制的酶。按照推理，这种酶功能的丧失会导致ANKRD52双敲除的细胞重拾miRNA介导的基因沉默。研究人员于是再次进行全基因组CRISPR–Cas9扫描，取荧光信号最暗的0.5%，其中最暗的是LATS2, CSNK1A1, MTOR或SRPK1四种基因的敲除。CSNK1A1 （I型酪蛋白激酶的一种）的敲除尤其在不影响miR-19水平的情况下完全恢复了荧光信号的下调，即基因沉默，该过程中AGO2磷酸化大幅度下调、AGO2靶基因间交互恢复正常。免疫共沉淀揭示CSNK1A1和AGO2间不依赖于RNA的相互作用。研究人员结合对I型酪蛋白激酶结构的了解，认为AGO2 S824–S834这一段的五个氨基酸残基是符合CSNK1A1的反应要求的，而且S828一处的磷酸化有可能引起分层的连锁反应。为了进一步确认这一点，CSNK1A1激酶活性分析法被随各种磷酸肽应用于AGO2 S824–S834。发现S828的磷酸化（可能还有S824）能介导从S831到S834的分层进一步磷酸化，使得AGO2不适合靶基因连接，直到ANKRD52–PPP6C磷酸酶使它恢复活性。

既然新发现的这种AGO2磷酸化机制在哺乳动物细胞系中如此活跃、属于miRNA介导的沉默所必需、能够调节靶基因的锚定，研究人员猜测S824–S834 的磷酸化是AGO2锚定到靶基因本身所引起的。针对这个假设他们设置了导致靶基因锚定过程故障但不影响miRNA的参与的突变AGO2，发现它的磷酸化受阻。向细胞中转染miRNA海绵——circRNA分子后，CSNK1A1介导的AGO2磷酸化被引发重新上调，（进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高了靶基因的表达水平。）

经过全转录组的交联免疫沉淀，研究人员发现AGO2 S824–S834突变型的miRNA靶基因更广泛，涵盖而不只所有野生型的靶基因。但期间某些转录物的沉默不受AGO2 S824–S834磷酸化的失去的影响。研究人员推测这一部分转录物应是尤其强的——它们总是竞争得到AGO2连接位点，在扩大的靶基因池中仍然取得胜利。最后研究人员探究了这些所谓较强转录物具体的特点：转录物如果半衰期长，与之结合的AGO就更有机会磷酸化。

AGO磷酸化或经由更多沉默因子的招募进一步深化，如CCR4-NOT蛋白复合体和 DDX6，使得整个有效的沉默过程得以完成。研究人员在讨论中谈到突变型AGO2与某些靶基因的高结合背后应该有更多原因，有必要对于这些靶基因特点进行进一步总结。而值得以后科学家们注意的是，以发育、生理、病理为背景的研究都应该注意到Arg蛋白的磷酸化，它从上游控制整个miRNA信号通路，从进化上来说也是高度保守的。